پروتکل ترنسفکشن: • معرفی: حامل ژن درما ترنسفر یک فرمول منحصر به فرد متشکل از نانوذرات می باشد که جهت ترنسفکشن نوکلئیک اسیدها (پلاسمید) به رده های سلولی یوکاریوتی استفاده می شود. این حامل دارای مزایای ذیل می باشد: قابلیت ردیابی در سلول قابلیت تولید انبوه کارآمدی برابر یا بالاتر از نمونه مشابه خارجی (برای مثال لیپوفکتامین محصول شرکت اینویتروژن آمریکا) در دسترس بودن و هزینه پایین تر نسبت به نمونه مشابه خارجی امکان اضافه کردن مستقیم کمپلکس های نوکلئیک اسید- ژن درما ترنسفر به سلول ها در محیط کشت امکان تهیه ژن درما ترنسفر با تعداد واکنش (Reaction number) مورد نظر • شرایط نگهداری: ژن درما ترنسفر را می توان تا یک ماه در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد نگهداری کرد، همچنین به مدت 6 ماه در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد قابل نگهداری می باشد. قبل از استفاده، اجازه دهید کاملا ذوب شده و به دمای تعادل اتاق برسد. • راهنمایی هایی جهت انجام ترنسفکشن: روش ذکر شده در ذیل برای ترنسفکشن رده های سلولی معمولی با پلاسمید رقیق شده (μg/μl 1) در آب استریل طراحی شده است. فرایند کشت و انتقال سلول ها در محیط استاندارد بدون سرم، متناسب با نوع سلول انجام شود. در حین کار از تکنیک آسپتیک استفاده شده و فقط از مواد استریل استفاده گردد. پلاسمیدهای DNA باید با کیفیت بالا بوده و در آب با گرید بیولوژی مولکولی تا غلظت نهایی (μg/μl 1) کاملا حل شوند. مقدار بهینه مورد استفاده از معرف ژن درما ترنسفر بستگی به نوع سلول دارد. غلظت های مختلف از 5 تا 20 میکرولیتر در هر میکروگرم از پلاسمید مورد سنجش قرار گرفته و به طور کلی مقدار بهینه، 5 تا 10 میکرولیتر در هر میکروگرم از پلاسمید است. این پروتکل را می توان برای استفاده با انواع مختلف سلول بهینه کرد و عوامل مختلفی همچون مقدار DNA مورد استفاده، مدت زمان انکوباسیون و ... را تغییر داد تا در صورت نیاز به بیان بالاتر و سمیت کمتر دست یافت. • روش انجام ترنسفکشن DNA پلاسمیدی: روش ذکر شده در ذیل برای پلیت 24 خانه مناسب می باشد. جهت اطلاع از روش انجام ترنسفکشن برای سایر پلیت ها به جدول انتهای صفحه مراجعه کنید. تمامی مقادیر و حجم ها به ازای هر چاهک ذکر شده است. جهت دستیابی به کارایی بالاتر، بیان بیشتر و کم کردن میزان سمیت، ترنسفکشن را با تراکم سلولی بالا انجام دهید. 1) سلول ها را از 24 ساعت قبل از ترنسفکشن در پلیت 24 خانه کشت دهید. برای دستیابی به ترنسفکشن ایده آل، بهتر است سلول ها در زمان ترنسفکشن به تراکم 85-80 % رسیده باشند. در این مرحله از محیط کشت مناسب حاوی 10% FBS استفاده نمایید. 2) جهت آماده سازی سلول ها برای ترنسفکشن، محیط کشت را در هر چاهک تغییر دهید. محیط بدون FBS جایگزین محیط دارای 10% FBS شود. 3) جهت تهیه معرف ژن درما ترنسفکت، 10 میکرولیتر از معرف را با حلال مناسب (آب استریل یا بافر Hepes) به حجم 25 میکرولیتر برسانید و به آرامی ورتکس نمایید. 4) همچنین جهت تهیه پلاسمید برای ترنسفکشن، 1 میکروگرم پلاسمید را با حلال مناسب (آب استریل یا بافر Hepes) به حجم 25 میکرولیتر برسانید (بر اساس سلول های مختلف، حلال مناسب انتخاب شود) و به آرامی ورتکس نمایید. 5) در این مرحله به سرعت پلاسمید را به معرف ژن درما ترنسفکت اضافه کنید (توجه: ترتیب اضافه کردن را برعکس انجام ندهید). به منظور تشکیل کمپلکس، 30 بار به آرامی محلول را پیپتاژ کرده و اجازه دهید کمپلکس ها بدون مزاحمت در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه تشکیل شوند (البته می توانید مدت زمان را بین 15 تا 30 دقیقه بهینه کنید). (توجه: اجازه ندهید واکنش کمپلکس بیش از 30 دقیقه ادامه یابد). 6) تمام کمپلکس (50 میکرولیتر) را به صورت قطره ای به محیط کشت (حاوی سلول ها و محیط) اضافه نمایید. با چرخش ملایم مخلوط کنید. 4 ساعت پس از ترنسفکشن محیط کشت را با محیط کشت کامل (حاوی 10% FBS) تعویض کنید. بهتر است این مدت زمان را بر اساس نوع سلول ها بهینه کنید. 7) بین 48 تا 72 ساعت پس از تیمار، می توانید کارایی ترنسفکشن را ارزیابی کنید (این مدت زمان را می توانید براساس نوع سلول ها بهینه کنید). با استفاده از میکروسکوپ فلوئورسنت، دستگاه فلوسایتومتری و روش های مناسب کارایی ترنسفکشن از نظر کیفی و کمی بررسی می شود. تعداد واکنش مقدار معرف در هر چاهک مقدار DNA در هر چاهک نوع پلیت 12 50 μl 5000 ng 6 خانه 60 10 μl 1000 ng 24 خانه 300 2 μl 200 ng 96 خانه